眼科手術(shù)顯微鏡作為奧林巴斯顯微鏡的一種類型,是*,從80年代末期才開始發(fā)展的。
眼科手術(shù)顯微鏡的原理是利用激光掃描束通過光柵針孔形成點(diǎn)光源,在熒光標(biāo)記標(biāo)本的焦平面上逐點(diǎn)掃描,采集點(diǎn)的光信號通過探測針孔到達(dá)光電倍增管(PMT),再經(jīng)過信號處理,在計(jì)算機(jī)監(jiān)視屏上形成圖像。
對于物鏡焦平面的焦點(diǎn)處發(fā)出的光在針孔處可以得到很好的會聚,可以全部通過針孔被探測器接收。而在焦平面上下位置發(fā)出的光在針孔處會產(chǎn)生直徑很大的光斑,對比針孔的直徑大小,則只有極少部分的光可以透過針孔被探測器接收。
而且隨著距離物鏡焦平面的距離越大,樣品所產(chǎn)生的雜散光在針孔處的彌散斑就越大,能透過針孔的能量就越少,因而在探測器上產(chǎn)生的信號就越小,影響也越小。正由于共焦顯微僅對樣本焦平面成像,有效的避免了衍射光和和散射光的干擾,使得它具有比普通顯微鏡更高的分辨率,并在生物學(xué)中獲得了廣泛的應(yīng)用。
激光共焦顯微鏡使用方便,與一般光學(xué)顯微鏡相似,且全部采用計(jì)算機(jī)直觀控制?;緹o須制樣,不損傷樣品。不需要做導(dǎo)電處理,也容許大尺寸樣品直接觀察,*不破壞樣品。幾十秒到一兩分鐘即完成全部的掃描,成像,測量采樣工作。
眼科手術(shù)顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場光源和局部平面成像模式,采用激光束作光源,激光束經(jīng)照明針孔,經(jīng)由分光鏡反射至物鏡,并聚焦于樣品上,對標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。
組織樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質(zhì),受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡,通過探測針孔時先聚焦,聚焦后的光被光電倍增管(PMT)探測收集,并將信號輸送到計(jì)算機(jī),處理后在計(jì)算機(jī)顯示器上顯示圖像。在這個光路中,只有在焦平面的光才能穿過探測針孔,焦平面以外區(qū)域射來的光線在探測小孔平面是離焦的,不能通過小孔。
因此,非觀察點(diǎn)的背景呈黑色,反差增加,成像清晰。由于照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的,焦平面上的點(diǎn)同時聚焦于照明針孔與探測針孔,焦平面以外的點(diǎn)不會在探測針孔處成像,即共聚焦。以激光作光源并對樣品進(jìn)行掃描,在此過程中兩次聚焦,故稱為激光掃描共聚焦顯微鏡。
奧林巴斯激光共焦顯微鏡從產(chǎn)生至今不斷的追求發(fā)展,顯微鏡的光源設(shè)計(jì)和分光采集技術(shù)也有較大的改進(jìn),主要集中在如下幾個方面:
現(xiàn)代的眼科手術(shù)顯微鏡可以根據(jù)研究需要選擇不同的激光器。選擇激光光源時,一方面要滿足研究工作對波長的需求,另一個方面要考慮到激光光源的壽命。一代激光共焦顯微鏡可以用棱鏡狹縫分光的新技術(shù),配上合適的激光源后,能夠擺脫傳統(tǒng)的波長濾片組的限制,連續(xù)和自由地選擇波長。顯微鏡的物鏡也做了較大的改進(jìn),不但具有平場復(fù)消色差特性,而且能與高速掃描功能相匹配。